பாலிமரேஸ் சங்கிலி தாக்கம் (PCR — Polymerase Chain Reaction)
ஏன் இது முக்கியம்? ஒரு சொட்டு ரத்தத்திலிருந்து, ஒரு தொல்லுயிரியல் எலும்பிலிருந்து — DNA ஒரு பில்லியன் மடங்கு பெருக்கி குற்றவியல் விசாரணைகளிலும் நோய் கண்டறிதலிலும் பயன்படுகிறது. PCR இந்த புரட்சியை உருவாக்கியது.
30 சுழற்சிகளில் 2³⁰ ≈ ஒரு பில்லியன் நகல்கள்; Taq பாலிமரேஸ் 95°C இல் செயலிழக்காது — Thermus aquaticus வெப்ப நீரூற்றில் வாழும் பாக்டீரியா என்று நினைத்துக்கொள்ளுங்கள்.
- பாலிமரேஸ் சங்கிலி தாக்கம் (PCR) கண்ணாடிக்குழலினுள் (in vitro) DNA பிரதிபண்ணப்படலை எவ்வாறு பிரதியாக்குகின்றது என விளக்குதல்.
- PCR கலவையின் கூறுகளையும் (template DNA, பிறைமர்கள், dNTPs, Taq பாலிமரேஸ், Mg²⁺) ஒரு வெப்பச்சுழற்சியின் மூன்று படிகளையும் விபரித்தல்.
- நோய்க்காரணி கண்டறிதல், தடயவியல் (forensics), மரபணுநோய் கண்டறிதல் போன்ற PCR பிரயோகங்களைக் கூறுதல்.
பாலிமரேஸ் சங்கிலி தாக்கம் (Polymerase Chain Reaction — PCR) என்பது குறிப்பிட்ட DNA தொடரிகளை கண்ணாடிக்குழலினுள் (in vitro) பிரதிபண்ண (copy) பயன்படும் ஒரு நுட்பமாகும். இது கலத்தினுள் நடைபெறும் DNA பிரதிபண்ணப்படலை (DNA replication) பிரதியாக்குகின்றது. பிரதிபண்ணப்படலில் போலவே, புதிய DNA பட்டிகையின் நீட்சித் தாக்கத்தை வினையூக்க (catalyse) ஒரு DNA பாலிமரேஸ் நொதியம் தேவைப்படுகின்றது.
1. PCR கலவையின் கூறுகள் (Ingredients of the PCR mix)
Taq DNA polymerase structure
Wikipedia → · CC
- படித்தகட்டு DNA (template DNA): பிரதிபண்ணப்பட வேண்டிய தொடரியைக் கொண்ட ஒற்றைப் பட்டிகை DNA.
- நான்கு டீஓக்சிறைபோநியூக்கிளியோரைட் மூவ்பொஸ்பேட்டுகள் (dNTPs): dATP, dGTP, dTTP, dCTP — புதிய பட்டிகையைக் கட்டும் மூலப்பொருட்கள்.
- இரண்டு பிறைமர்கள் (two primers): ஒவ்வொன்றும் சிறிய எண்ணிக்கையிலான நியூக்கிளியோரைட்டுகளைக் கொண்ட (oligonucleotide), இலக்கு DNA இன் 3' முனைக்கு நிரப்பான குறிப்பிட்ட DNA தொடரி. இரு பட்டிகைகளையும் பிரதிபண்ண இரு பிறைமர்கள் தேவை — ஒவ்வொன்றும் ஒரு பட்டிகையின் 3' முனையுடன் பிணைகின்றது.
- Taq DNA பாலிமரேஸ்: வெப்பவுறுதியான (heat-stable) நொதியம்; Thermus aquaticus எனும் வெப்பநாடிப் பாக்டீரியாவிலிருந்து (thermophilic bacterium) தனிமைப்படுத்தப்பட்டது.
- Mg²⁺ அயன்கள்: தாக்கத்திற்குத் தேவையான இணைக்காரணி (cofactor).
2. ஒரு வெப்பச்சுழற்சியின் மூன்று படிகள் (Three steps of one thermal cycle)
DNA replication — strand separation
Wikipedia → · CC
- இயற்கையகற்றல் (Denaturation): PCR கலவை 95°C ஆகச் சூடேற்றப்படுகின்றது. இந்த வெப்பநிலையில் இரட்டைப் பட்டிகை DNA இரு ஒற்றைப் பட்டிகைகளாகப் பிரிகின்றது.
- இணைதல் (Annealing): குறைந்த வெப்பநிலையில் பிறைமர்கள் இயற்கையகற்றப்பட்ட படித்தகட்டு DNA இன் நிரப்புத் தொடரியுடன் பிணைகின்றன. இணைதல் வெப்பநிலை பிறைமரின் தொடரியையும் நீளத்தையும் சார்ந்தது.
- நீட்சி (Extension): பயன்படுத்தப்படும் DNA பாலிமரேஸின் உகந்த வெப்பநிலையில், பிறைமரிலிருந்து புதிய DNA தொகுக்கப்படுகின்றது; படித்தகட்டு DNA இன் நிரப்புப் பிரதி ஒன்று உருவாகின்றது.
முதல் வெப்பச்சுழற்சியின் (denaturation, annealing, extension) முடிவில், ஒவ்வொரு பட்டிகைக்கும் ஒரு பிரதி உருவாகின்றது; ஆனால் இவை இலக்கு தொடரியை விட நீளமானவை. சில சுழற்சிகளுக்குப் பின் இலக்கு DNA இன் சரியான பிரதி உருவாகின்றது. அதன் பின் ஒவ்வொரு சுழற்சியிலும் DNA அளவு முளைவகையாக (exponentially) — 2, 4, 8, 16… இரட்டிக்கின்றது. வழமையான PCR ஒன்றில் 35–40 சுழற்சிகள் உள்ளன; முடிவில் ஒற்றைப் படித்தகட்டு மூலக்கூறிலிருந்து மில்லியன் கணக்கான பிரதிகள் கிடைக்கும்.
3. தானியங்கி வெப்பச்சுழற்சி (Automated thermal cycler)
PCR tubes in a thermal cycler
Wikipedia → · CC
மீளும் சுழற்சிகள் தானியங்கியாக்கப்பட்டு ஒரு PCR இயந்திரத்தில் (வெப்பச்சுழற்சி இயந்திரம் — thermal cycler) நடத்தப்படுகின்றன. PCR கலவை PCR குழாய்களில் தயாரிக்கப்பட்டு, இயந்திரத்தின் துளைகளில் (wells) வைக்கப்படுகின்றன. PCR என்பது சிறிய அளவு படித்தகட்டிலிருந்து உயர் துல்லியத்துடன் (high accuracy) அதிக எண்ணிக்கையிலான DNA பிரதிகளை விரைவாகப் பெறும் முறையாகும். இது குளோனாக்கல் (cloning) நடைமுறையில் முக்கிய நுட்பமாகும்.
4. PCR இன் பயன்கள் (Applications of PCR)
- மருத்துவ மாதிரிகளில் தொற்றுக்காரணிகளைக் கண்டறிதல் (உ.ம்: HIV, மஞ்சள்காமாலை / hepatitis, மலேரியா).
- மரபணுநோய்களை ஏற்படுத்தும் விகற்பங்களை (mutations) ஆராய்தல் (உ.ம்: சிஸ்டிக் ஃபைப்ரோசிஸ், அரிவாளுருக் கலக் குருதிச்சோகை / sickle cell anaemia, பினைல்கீட்டோனூரியா).
- தடயவியல் ஆய்வுகூடங்கள் (forensics) — ஒரு துளி இரத்தம் அல்லது ஒற்றை முடியிலிருந்தே DNA பெருக்கப்படுவதால் மிகச் சிறிய அளவே போதும்.
- DNA தொடரியாக்கல் (DNA sequencing) PCR ஐ அண்டியுள்ளது.
- கூர்ப்பு உயிரியலில் (evolutionary biology) இனங்களின் உறவுகளை ஆராய்தல்; மானிடவியல், தொல்லியல் ஆய்வுகள்.
- தொல்லுயிரியலாளர்கள் (paleontologists) அழிந்த இனங்களின் அல்லது மில்லியன் ஆண்டுகள் பழமையான தொல்லுயிர்களின் DNA ஐப் பெருக்க பயன்படுத்துகின்றனர்.
| படி / Step | வெப்பநிலை / Temp | நிகழ்வது / What happens |
|---|---|---|
| இயற்கையகற்றல் (Denaturation) | 95°C | இரட்டைப் பட்டிகை DNA இரு ஒற்றைப் பட்டிகைகளாகப் பிரிகின்றது |
| இணைதல் (Annealing) | குறைந்த வெப்பநிலை | பிறைமர்கள் நிரப்புத் தொடரியுடன் பிணைகின்றன |
| நீட்சி (Extension) | பாலிமரேஸின் உகந்த வெப்பநிலை | Taq பாலிமரேஸ் புதிய DNA ஐத் தொகுக்கின்றது |
PCR — Polymerase Chain Reaction
IQOG-CSIC
- Protein Chain Reaction
- Polymerase Chain Reaction
- Plasmid Cloning Reaction
- Primer Coupling Reaction
- Phosphate Copying Reaction
பதில் / Answer
- உயிருடலினுள் (in vivo) / In vivo
- கண்ணாடிக்குழலினுள் (in vitro) / In vitro
- கருவினுள் மட்டும் / Only in nucleus
- இழைமணியில் மட்டும் / Only in mitochondria
- -
பதில் / Answer
- படியெடுத்தல் (transcription) / Transcription
- மொழிபெயர்த்தல் (translation) / Translation
- DNA பிரதிபண்ணப்படல் (replication) / DNA replication
- ஒடுக்கற்பிரிவு / Meiosis
- -
பதில் / Answer
- DNA இலிகேஸ் / DNA ligase
- Taq DNA பாலிமரேஸ் / Taq DNA polymerase
- மட்டுப்படுத்தல் நொதியம் / Restriction enzyme
- ஹெலிக்கேஸ் / Helicase
- பிறைமேஸ் / Primase
பதில் / Answer
- Escherichia coli
- Thermus aquaticus
- Agrobacterium tumefaciens
- Bacillus subtilis
- Saccharomyces cerevisiae
பதில் / Answer
- விலை மலிவானது / It is cheap
- உயர் வெப்பத்தை (95°C) தாங்கக்கூடியது / It resists high temperature (95°C)
- RNA தொகுக்கின்றது / It makes RNA
- பிறைமர் தேவையில்லை / Needs no primer
- -
பதில் / Answer
- படித்தகட்டு DNA / Template DNA
- dNTPs
- ரைபோசோம் / Ribosomes
- பிறைமர்கள் / Primers
- Mg²⁺
பதில் / Answer
- நான்கு டீஓக்சிறைபோநியூக்கிளியோரைட் மூவ்பொஸ்பேட்டுகள் / Four deoxyribonucleotide triphosphates
- அமினோ அமிலங்கள் / Amino acids
- RNA பிறைமர்கள் / RNA primers
- மட்டுப்படுத்தல் நொதியங்கள் / Restriction enzymes
- -
பதில் / Answer
- ஒன்று / One
- இரண்டு / Two
- மூன்று / Three
- நான்கு / Four
- -
பதில் / Answer
- 5' முனை / 5' end
- 3' முனை / 3' end
- மையம் / Middle
- இரு முனைகளும் / Both ends
- -
பதில் / Answer
- குறுகிய RNA தொடரி / A short RNA sequence
- குறிப்பிட்ட DNA ஒலிகோநியூக்கிளியோரைட் / A specific DNA oligonucleotide
- ஒரு புரதம் / A protein
- ஒரு லிப்பிட் / A lipid
- -
பதில் / Answer
- படித்தகட்டு / Template
- இணைக்காரணி (cofactor) / Cofactor
- பிறைமர் / Primer
- நியூக்கிளியோரைட் / Nucleotide
- -
பதில் / Answer
- இணைதல் → இயற்கையகற்றல் → நீட்சி / Annealing → Denaturation → Extension
- இயற்கையகற்றல் → இணைதல் → நீட்சி / Denaturation → Annealing → Extension
- நீட்சி → இணைதல் → இயற்கையகற்றல் / Extension → Annealing → Denaturation
- இயற்கையகற்றல் → நீட்சி → இணைதல் / Denaturation → Extension → Annealing
- -
பதில் / Answer
- 37°C
- 55°C
- 72°C
- 95°C
- 100°C
பதில் / Answer
- பிறைமர் பிணைகின்றது / Primer binds
- இரட்டைப் பட்டிகை இரு ஒற்றைப் பட்டிகைகளாகப் பிரிகின்றது / Double strand separates into two single strands
- புதிய DNA தொகுக்கப்படுகின்றது / New DNA is synthesised
- DNA உடைக்கப்படுகின்றது / DNA is degraded
- -
பதில் / Answer
- இயற்கையகற்றல் / Denaturation
- இணைதல் (annealing) / Annealing
- நீட்சி / Extension
- குளோனாக்கல் / Cloning
- -
பதில் / Answer
- dNTP செறிவு / dNTP concentration
- பிறைமரின் தொடரி + நீளம் / Sequence and length of the primer
- குழாயின் அளவு / Tube size
- Mg²⁺ வண்ணம் / Colour of Mg²⁺
- -
பதில் / Answer
- பட்டிகைகள் பிரிகின்றன / Strands separate
- பிறைமரிலிருந்து புதிய DNA தொகுக்கப்படுகின்றது / New DNA is synthesised from the primer
- பிறைமர் நீக்கப்படுகின்றது / Primer is removed
- DNA வெட்டப்படுகின்றது / DNA is cut
- -
பதில் / Answer
- 95°C
- DNA பாலிமரேஸின் உகந்த வெப்பநிலை / The optimum temperature of the polymerase
- 4°C
- 0°C
- -
பதில் / Answer
- நேரியல் முறையில் / Linearly
- முளைவகையாக — 2, 4, 8, 16 / Exponentially — 2, 4, 8, 16
- மாறாமல் / It stays constant
- குறைகின்றது / It decreases
- -
பதில் / Answer
- 2–3
- 10–15
- 35–40
- 100–200
- 500
பதில் / Answer
- சில பிரதிகள் / A few copies
- மில்லியன் கணக்கான பிரதிகள் / Millions of copies
- ஒரு பிரதி மட்டும் / Only one copy
- RNA மட்டும் / Only RNA
- -
பதில் / Answer
- நொதி உலை / Incubator
- வெப்பச்சுழற்சி இயந்திரம் (thermal cycler) / Thermal cycler
- மையவிலக்கி / Centrifuge
- ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டர் / Spectrometer
- -
பதில் / Answer
- மெதுவான முறை / It is slow
- சிறிய அளவு படித்தகட்டிலிருந்து விரைவாக, உயர் துல்லியத்துடன் பல பிரதிகள் / Rapid, accurate copies from a tiny template
- உயிருடலுக்குள் மட்டுமே / Works only in vivo
- நொதியம் தேவையில்லை / Needs no enzyme
- -
பதில் / Answer
- ATP தொகுப்பு / ATP synthesis
- தொற்றுக்காரணிகளைக் கண்டறிதல் (HIV, மலேரியா) / Detecting infectious agents (HIV, malaria)
- ஒளிச்சேர்க்கை / Photosynthesis
- புரதச் சுருள் மடிப்பு / Protein folding
- -
பதில் / Answer
- இரத்தம் தேவையில்லை / No blood needed
- மிகச் சிறிய அளவு DNA போதும் (ஒரு துளி இரத்தம், ஒற்றை முடி) / A tiny amount of DNA suffices (a drop of blood, a single hair)
- விலை இல்லை / It is free
- நொதியம் இல்லாமல் வேலை செய்கின்றது / It works without enzymes
- -
பதில் / Answer
- காசநோய் / Tuberculosis
- அரிவாளுருக் கலக் குருதிச்சோகை / Sickle cell anaemia
- எலும்பு முறிவு / Bone fracture
- போலியோ / Polio
- -
பதில் / Answer
- DNA தொடரியாக்கல் (sequencing) / DNA sequencing
- ஒளிச்சேர்க்கை / Photosynthesis
- நொதிச் செரிமானம் / Enzyme digestion
- சுவாசம் / Respiration
- -
பதில் / Answer
- அழிந்த இனங்களின் / பழமையான தொல்லுயிர்களின் DNA ஐப் பெருக்க / To amplify DNA from extinct species / ancient fossils
- ATP தொகுக்க / To make ATP
- புரதம் தொகுக்க / To make protein
- கலத்தைப் பிரிக்க / To divide cells
- -
பதில் / Answer
- அவை இலக்கு தொடரியை விட நீளமானவை / They are longer than the intended target
- அவை சரியான இலக்கு நீளமானவை / They are exactly the target length
- அவை RNA / They are RNA
- பிரதிகள் உருவாகாது / No copies form
- -
பதில் / Answer
- PCR கலவையின் ஐந்து கூறுகளைப் பட்டியலிடுக. / List the five ingredients of the PCR mix. (3)
- ஒரு வெப்பச்சுழற்சியின் மூன்று படிகளையும் அவற்றின் வெப்பநிலைகளுடன் கூறுக. / State the three steps of one thermal cycle with their temperatures. (3)
- PCR இல் சாதாரண பாலிமரேஸுக்குப் பதிலாக Taq பாலிமரேஸ் ஏன் பயன்படுத்தப்படுகின்றது? / Why is Taq polymerase used instead of an ordinary polymerase? (2)
- PCR இன் இரு பயன்பாடுகளைக் கூறுக. / Give two applications of PCR. (2)
மாதிரி விடை / Model answer
(ஆ) இயற்கையகற்றல் 95°C (பட்டிகை பிரிதல்); இணைதல் குறைந்த வெப்பநிலை (பிறைமர் பிணைதல்); நீட்சி பாலிமரேஸின் உகந்த வெப்பநிலை (புதிய DNA தொகுப்பு). (3)
(இ) 95°C இல் சாதாரண பாலிமரேஸ் இயற்கையகற்றப்படும்; Taq வெப்பநாடி அங்கியான Thermus aquaticus இலிருந்து பெறப்பட்டதால் வெப்பவுறுதியானது, ஒரு முறை சேர்த்தாலே போதும். (2)
(ஈ) தொற்றுக்காரணி கண்டறிதல் (HIV/மலேரியா); தடயவியல்/மரபணுநோய் கண்டறிதல்/DNA தொடரியாக்கல் — ஏதேனும் இரண்டு. (2)
PCR கலவையின் கூறுகளையும், ஒரு வெப்பச்சுழற்சியின் மூன்று படிகளையும், பிரதிகள் முளைவகையாக அதிகரிப்பதையும், PCR இன் முக்கிய பயன்பாடுகளையும் விபரிக்க. / Describe the ingredients of the PCR mix, the three steps of one thermal cycle, the exponential increase in copies, and the main applications of PCR.
விடைக் குறிப்புகள் / Answer outline
• படி 1 இயற்கையகற்றல் (95°C) — பட்டிகை பிரிதல்.
• படி 2 இணைதல் (குறைந்த வெப்பநிலை) — பிறைமர் 3' முனையுடன் பிணைதல்.
• படி 3 நீட்சி (உகந்த வெப்பநிலை) — Taq புதிய பட்டிகையைத் தொகுத்தல்.
• முளைவகைப் பெருக்கம் — 2, 4, 8, 16…; 35–40 சுழற்சிகள் → மில்லியன் கணக்கான பிரதிகள்.
• பயன்கள் — தொற்றுக்காரணி கண்டறிதல், தடயவியல், மரபணுநோய் கண்டறிதல், DNA தொடரியாக்கல், கூர்ப்பு/தொல்லுயிரியல்.
பதில் / Show answer
- DNA-வை மிகுதியாகப் பெருக்கும் முறை.
- 3 படிகள்: நிலைகுலைவு (94°C) → ஒட்டுகை (~55°C) → நீட்சி (72°C).
- Taq பாலிமரேஸ் (வெப்ப நிலைப்புத்தன்மை); வெப்பச்சுழற்சி.