ஜெல் மின்பிரிப்பும் DNA பகுப்பாய்வும் (Gel Electrophoresis & DNA Analysis)
ஏன் இது முக்கியம்? DNA வெட்டினோம் — ஆனால் சரியான அளவில் வெட்டியோமா என்று எப்படி தெரியும்? ஜெல் மின்பாய்வு அந்த "பார்க்கும்" சாளரம் — DNA கண்ணுக்கு தெரியாதது, ஜெல்லில் பட்டைகளாக தெரிகிறது.
DNA எதிர்மறை மின்சுமை கொண்டதால் (+) அனோடை நோக்கி ஓடுகிறது; சிறியவை வேகமாக ஓடுகின்றன; 1kb marker பட்டியை benchmark ஆக பயன்படுத்துகிறோம்.
- அகரொஸ் ஜெல் மின்னயனம் (agarose gel electrophoresis) மூலம் DNA மூலக்கூறுகள் பருமனுக்கேற்ப எவ்வாறு வேறாக்கப்படுகின்றன என விளக்குதல்.
- DNA ஆயி (probe), கலப்புப்பிறப்பாக்கம் (hybridization), சதேர்ன் ஒத்தி (Southern blotting) ஆகியவற்றின் கொள்கையை விபரித்தல்.
- DNA விரலடையாள முறையையும் (DNA fingerprinting) STR குறிப்பான்களின் பயன்பாட்டையும் விளக்குதல்.
1. மின்னயனம் (Electrophoresis) என்றால் என்ன?
Gel electrophoresis apparatus
Wikipedia → · CC
மட்டுப்படுத்தல் நொதியங்களால் (restriction enzymes) DNA வெட்டப்படும்போது வௌ;வேறு பருமனுள்ள DNA துண்டங்களின் கலவை உருவாகின்றது. DNA உடனான பல பயன்பாடுகளில் இத்துண்டங்களை அவற்றின் பருமனுக்கேற்ப வேறாக்குதல் (separation) முக்கியமாகின்றது. மின்புலமொன்றில் அவற்றின் அசையும் ஆற்றலுக்கேற்ப, ஏற்றம் (charge) கொண்ட பெரிய மூலக்கூறுகளை — DNA, RNA, புரதம் போன்றவற்றை — வேறாக்கும் தொழினுட்பம் மின்னயனம் (electrophoresis) எனப்படும்.
மின்புலத்தில் மூலக்கூறு ஒன்றின் அசைவு வேகம் அதன் தேறிய ஏற்றத்திலும் (net charge) பருமனிலும் தங்கியுள்ளது. நிய+க்கிளிக்கமிலங்களைப் பொறுத்தவரை தேறிய ஏற்றம் மூலக்கூறின் நீளத்தில் தங்கியிருப்பதால், வேறாக்கல் முதன்மையாக பருமனை அடிப்படையாகக் கொண்டது.
2. அகரொஸ் ஜெல் மின்னயனம் (Agarose Gel Electrophoresis)
DNA bands on agarose gel
Wikipedia → · CC
DNA வேறாக்கலில் அகரொஸ் ஜெல் மின்னயனமே பெரும்பாலும் பயன்படுத்தப்படும் தொழினுட்பமாகும். அகரொஸ் (agarose) என்பது ஒரு வகைக் கடற்சாதாழையிலிருந்து (seaweed) பெறப்பட்டுச் சுத்திகரிக்கப்பட்ட அகர் (purified agar) ஆகும்; இது ஒரு பல்சக்கரைட் தாயத்தை (polysaccharide matrix) ஏற்படுத்தும்.
உபகரணத்தில் தாங்கல் கரைசலில் (buffer) ஜெல் இடப்பட்டு, அதன் இரு அந்தங்களிலும் ஒரு கதோடும் (cathode) ஒரு அனோடும் (anode) வைக்கப்படும். ஜெல்லைத் தயார் செய்யும்போது கிணறுகள் (wells) ஏற்படுத்தப்பட்டு, அவற்றில் DNA சுமையேற்றப்படும். மின் விநியோகம் (power supply) மூலம் மின்னோட்டம் வழங்கப்படும்போது, எதிராக மின்னேற்றப்பட்ட (negatively charged) DNA மூலக்கூறுகள் ஜெல்லினூடாக அனோட்டை (நேர் முனை) நோக்கி அசையும்.
வேறாக்கப்பட்ட DNA எதிடியம் புரோமைட்டால் (ethidium bromide) சாயமேற்றப்பட்டு, ருஏ ஒளி (UV light) படவிடப்பட்டுக் காட்சிப்படுத்தப்படும். அறியப்பட்ட பருமன்களைக் கொண்ட DNA பருமன் குறிப்பான் (DNA size marker / ladder) மாதிரிகளுடன் சேர்த்து ஓடவிடப்படுகின்றது; இதன்மூலம் ஒவ்வொரு பட்டையின் (band) பருமன் மதிப்பிடப்படும்.
3. DNA ஆயிகளும் கலப்புப்பிறப்பாக்கமும் (DNA Probes & Hybridization)
எதிடியம் புரோமைட்டுப் போன்ற சாயங்கள் ஜெல்லில் இரட்டைப்பட்டிகை DNA பட்டையின் இருக்கையைக் காட்டினாலும், அவை குறிப்பிட்ட நிய+க்கிளியோரைட் தொடரியைக் (nucleotide sequence) கொண்ட பட்டையை மற்றையதிலிருந்து வேறுபிரித்துக் காட்டாது. அவ்வாறான ஒரு பட்டையை ஏனைய பல பட்டைகளுக்கிடையே இனங்காண்பதற்கு DNA ஆயி (probe) பயன்படுத்தப்படும்.
DNA ஆயி என்பது நிரப்புகின்ற (complementary) நிய+க்கிளிக்கமிலத் தொடரிகளின் இருக்கையைக் கண்டறியப் பயன்படும், தனித்த பட்டிகை கொண்ட சுட்டியிடப்பட்ட (single-stranded labelled) DNA இன் ஒரு துண்டமாகும். சுட்டியிடல் (labeling) என்பது DNA இழையைக் கண்டறிவதற்கான சமிக்ஞையைத் தரும் விதமாக அதனை மாற்றுதலாகும் — கதிர்த்தொழிற்பாடுடைய சமதானியை (radioactive isotope) இணைத்தல் அல்லது உறிஞ்சியொளிவீசும் மூலக்கூறை (fluorescent molecule) சேர்த்தல் மூலம் இது மேற்கொள்ளப்படும்.
தனித்த பட்டிகையாலான DNA ஆயி, நிரப்புகின்ற தனித்த பட்டிகை DNA அல்லது RNA உடன் கலப்புப்பிறப்பாக்கம் (hybridization) செய்யும். எனவே ஆயியுடன் இணைப்பதற்கு முன், இரட்டைப்பட்டிகை DNA இயற்கையகற்றப்படல் (denaturation) வேண்டும்.
4. சதேர்ன் ஒத்தி (Southern Blotting)
Southern blot procedure
Wikipedia → · CC
ஜெல்லிலுள்ள இயற்கையகற்றப்பட்ட பட்டைகள், சதேர்ன் ஒத்தி (Southern blotting) எனப்படும் செயன்முறை ஊடாக நைதரோசெலுலோசு (nitrocellulose) அல்லது நைலோன் மென்சவ்வு வடிக்கு (nylon filter membrane) இடமாற்றப்பட்டு நிலைநிறுத்தப்படும். பின்னர் சுட்டியிடப்பட்ட ஆயி மென்சவ்வுக்குச் சேர்க்கப்பட்டு மீளமைப்புச் (renature) செய்யவிடப்படும்.
மென்சவ்வுடன் பொருத்தப்பட்ட நிரப்புகின்ற தொடரிகளுடன் மட்டுமே ஆயிகள் வலிமையாகப் பிணையும். மென்சவ்வு கழுவப்படும்போது, இலக்குத் தொடரியுடன் பிணைந்த ஆயிகள் தவிர ஏனையவை அகற்றப்படும். ஆயி கதிர்த்தொழிற்பாட்டுக்குரியதாயின் இலக்குப் பட்டை சுயகதிரியல் (autoradiography) மூலமும், உறிஞ்சியொளிவீசும் சாயத்தால் சுட்டியிடப்பட்டிருந்தால் ருஏ ஒளி மூலமும் இனங்காணப்படும்.
5. DNA விரலடையாள முறை (DNA Fingerprinting)
DNA fingerprinting
Wikipedia → · CC
ஒரு தனிநபரின் தனித்துவமான பிறப்புரிமைக் குறிப்பான்களின் தொகுப்பு அதன் DNA விரலடையாளத்தை (DNA fingerprint / genetic profile) உருவாக்குகின்றது. இக்குறிப்பான்கள் STR குறிப்பான்கள் (Short Tandem Repeats) அல்லது நுண்துணைக்கோள் DNA (microsatellite DNA) எனப்படும். ஈயூக்கரியோட்டிக் DNA இல், 2 முதல் 6 காரயிணைகள் (base pairs) தொடர்ச்சியாக 100–1000 முறை மீளப்படும் சில குறியீடற்ற (non-coding) தொடரிகள் உள்ளன; இவற்றின் நீளம் தனிநபர்களிடையே வேறுபடுவதால் குறிப்பான்களாகப் பயன்படுகின்றன.
STR குறிப்பான்கள் Pஊசு (PCR) மூலம் பெருக்கப்பட்டு ஜெல் மின்னயனத்தால் வேறாக்கப்படுகின்றன. ஒரே குறிப்பான் போதாது; பல குறிப்பான்கள் சேர்த்துப் பயன்படுத்தப்படும்போது ஒரே வடிவம் கிடைக்கும் நிகழ்தகவு குறைகின்றது. 13 குறிப்பான்கள் பயன்படுத்தப்படின் இந்நிகழ்தகவு 10 பில்லியன் முதல் பல ட்ரில்லியன் வரை ஆகும்; உலக மக்கள்தொகை ~7 பில்லியன் ஆதலால், இரு தனிநபர்கள் ஒரே விரலடையாளம் கொண்டிருத்தல் மிக அரிது.
| STR குறிப்பான்களின் சிறப்புகள் |
|---|
| பிறப்புரிமைத் தொகுதியில் (genome) அடிக்கடி காணப்படுகின்றன. |
| PCR மூலம் இலகுவாகப் பெருக்கப்படுகின்றன. |
| உயர் மாறுபாட்டுத்தன்மை (highly variable polymorphisms) கொண்டவை. |
| பல வகைப்படுத்தப்பட்ட STR கள் கிடைக்கின்றன. |
6. DNA விரலடையாளத்தின் பயன்பாடுகள்
- குற்றவாளி / பாதிக்கப்பட்டோர் இனங்காணல்: குற்ற இடத்திலிருந்து பெறப்பட்ட உயிரியல் பொருளின் விரலடையாளம் சந்தேக நபர்களின் விரலடையாளத்துடன் ஒப்பிடப்படும்; நீதிமன்றங்கள் இதை ஏற்கின்றன.
- தந்தை உரிமைச் சோதனை (paternity testing): குழந்தையின் விரலடையாளம் பெற்றோர் இருவரிலும் ஒருவருடன் முற்றாக ஒத்திராது; எனினும் சில குறிப்பான்களைத் தந்தையிடமிருந்தும் சிலவற்றைத் தாயிடமிருந்தும் பெறும். எனவே தந்தைமையை உறுதி / நிராகரிக்கப் பயன்படும்.
- தொற்று நோய்க்காரணிகளை இனங்காணல்: நோய்க்காரி நுண்ணுயிரின் விரலடையாளத்தைப் பெறும் ஆயி/பிரைமர்கள் அறியப்படின், நோயாளியில், உணவில் அல்லது நீரில் அவ்வுயிர் இருப்பதைக் கண்டறியலாம்.
Gel Electrophoresis
Amoeba Sisters
- நிறம் மட்டும் / Colour only
- மின்புலத்தில் ஏற்றம் + பருமன் / Charge + size in an electric field
- கொதிநிலை / Boiling point
- கரைதிறன் மட்டும் / Solubility only
- அடர்த்தி மட்டும் / Density only
பதில் / Answer
- பொலியக்கிரிலமைட் / Polyacrylamide
- அகரொஸ் (agarose) / Agarose
- செலுலோசு / Cellulose
- சிலிக்கா / Silica
- ஸ்டார்ச் / Starch
பதில் / Answer
- பாக்டீரியா / Bacteria
- ஒரு வகைக் கடற்சாதாழை / A type of seaweed
- விலங்குத் தோல் / Animal skin
- தாவர வேர் / Plant root
- -
பதில் / Answer
- கதோடு (எதிர் முனை) / Cathode (negative)
- அனோடு (நேர் முனை) / Anode (positive)
- இரண்டிலும் / Both
- எதிலும் இல்லை / Neither
- மையம் / Centre
பதில் / Answer
- நேர் ஏற்றம் கொண்டது / It is positively charged
- பொஸ்பேட் முதுகெலும்பு எதிர் ஏற்றம் கொண்டது / Phosphate backbone is negatively charged
- ஏற்றமற்றது / It is neutral
- கனமானது / It is heavy
- -
பதில் / Answer
- பெரிய துண்டங்கள் / Large fragments
- சிறிய துண்டங்கள் / Small fragments
- அனைத்தும் சமம் / All equal
- நடுத்தர துண்டங்கள் மட்டும் / Only medium
- -
பதில் / Answer
- கிணறுகள் (wells) / Wells
- அனோடு / Anode
- தாங்கல் தொட்டி / Buffer tank
- மென்சவ்வு / Membrane
- -
பதில் / Answer
- அயோடின் / Iodine
- எதிடியம் புரோமைடு / Ethidium bromide
- மெத்திலீன் நீலம் / Methylene blue
- யுடின் / Eosin
- -
பதில் / Answer
- காட்சி ஒளி / Visible light
- ருஏ (UV) ஒளி / UV light
- அகச்சிவப்பு / Infrared
- X-கதிர் / X-ray
- -
பதில் / Answer
- DNA ஆயி / DNA probe
- DNA பருமன் குறிப்பான் (ladder) / DNA size marker
- பிரைமர் / Primer
- நொதியம் / Enzyme
- -
பதில் / Answer
- பிரைமர் / Primer
- DNA ஆயி (probe) / DNA probe
- லிகேஸ் / Ligase
- வெக்டர் / Vector
- -
பதில் / Answer
- வெப்பம் மட்டும் / Heat only
- கதிர்த்தொழிற்பாட்டு சமதானி அல்லது உறிஞ்சியொளிவீசும் மூலக்கூறு / Radioactive isotope or fluorescent molecule
- உப்பு சேர்த்தல் / Adding salt
- குளிரூட்டல் / Cooling
- -
பதில் / Answer
- மீளமைப்பு / Renatured
- இயற்கையகற்றல் (denaturation) / Denatured
- வெட்டப்படல் / Cut
- பெருக்கப்படல் / Amplified
- -
பதில் / Answer
- நோதர்ன் ஒத்தி / Northern blotting
- சதேர்ன் ஒத்தி (Southern blotting) / Southern blotting
- மேற்கு ஒத்தி / Western blotting
- மின்னயனம் / Electrophoresis
- -
பதில் / Answer
- கண்ணாடித் தகடு / Glass plate
- நைதரோசெலுலோசு / நைலோன் மென்சவ்வு / Nitrocellulose / nylon membrane
- அகரொஸ் ஜெல் / Agarose gel
- பிளாஸ்மிட் / Plasmid
- -
பதில் / Answer
- சுயகதிரியல் (autoradiography) / Autoradiography
- எரித்தல் / Burning
- மணம் / Smell
- எடை / Weighing
- -
பதில் / Answer
- கோடான்கள் / Codons
- STR (Short Tandem Repeats) குறிப்பான்கள் / STR markers
- இன்ட்ரான்கள் மட்டும் / Only introns
- புரோமோட்டர்கள் / Promoters
- -
பதில் / Answer
- 1 மட்டும் / Only 1
- 2 முதல் 6 / 2 to 6
- 10 முதல் 20 / 10 to 20
- 50 முதல் 100 / 50 to 100
- -
பதில் / Answer
- புரதம் தொகுக்கின்றன / They make proteins
- மாறுபாடுகள் வெளித்தோற்றத்தை (phenotype) பாதிக்காது / Variations don't affect phenotype
- DNA ஐ அழிக்கின்றன / They destroy DNA
- தாக்கத்தை விரைவாக்கும் / They speed reactions
- -
பதில் / Answer
- சதேர்ன் ஒத்தி / Southern blotting
- Pஊசு (PCR) / PCR
- மின்னயனம் / Electrophoresis
- ஒளிச்சேர்க்கை / Photosynthesis
- -
பதில் / Answer
- விலை குறைக்க / To reduce cost
- ஒரே வடிவம் கிடைக்கும் நிகழ்தகவைக் குறைக்க / To reduce the probability of the same pattern
- வேகத்திற்காக / For speed
- நிறத்திற்காக / For colour
- -
பதில் / Answer
- 1 இல் 10 / 1 in 10
- 10 பில்லியன் முதல் பல ட்ரில்லியன் இல் 1 / 1 in 10 billion to several trillion
- 1 இல் 100 / 1 in 100
- 1 இல் 2 / 1 in 2
- -
பதில் / Answer
- குழந்தை தந்தையுடன் முற்றாக ஒத்திருக்கும் / Child is identical to father
- குழந்தை சில குறிப்பான்களைத் தந்தையிடமிருந்தும் சிலவற்றைத் தாயிடமிருந்தும் பெறும் / Child shares some markers from each parent
- குழந்தைக்கு DNA இல்லை / Child has no DNA
- தாயை மட்டும் காட்டும் / Shows only mother
- -
பதில் / Answer
- நிறத்தால் / By colour
- அறியப்பட்ட ஆயி/பிரைமர்களால் உயிரின் இருப்பைக் கண்டறிதல் / Known probes/primers detect the organism's presence
- எடையால் / By weight
- மணத்தால் / By smell
- -
பதில் / Answer
- DNA ஐ அழிக்கும் / They destroy DNA
- குறிப்பிட்ட தொடரியைக் கொண்ட பட்டையை வேறுபிரித்துக் காட்டாது / Cannot distinguish a band with a specific sequence
- DNA ஐ பெருக்கும் / They amplify DNA
- அனோட்டை மாற்றும் / They reverse the anode
- -
பதில் / Answer
- எல்லாப் பட்டைகளுடனும் / All bands
- நிரப்புகின்ற தொடரிகளுடன் / Complementary sequences
- மென்சவ்வுடன் / The membrane itself
- அனோட்டுடன் / The anode
- -
பதில் / Answer
- DNA, RNA, புரதம் / DNA, RNA, proteins
- லிப்பிட்டுகள் மட்டும் / Only lipids
- வாயுக்கள் / Gases
- உலோகங்கள் / Metals
- -
பதில் / Answer
- நிறம் / Colour
- பருமன் (size) / Size
- வெப்பம் / Temperature
- மணம் / Smell
- -
பதில் / Answer
- DNA ஐ வெட்டுகின்றன / They cut DNA
- மூலக்கூறுகளின் அசைவை மட்டுப்படுத்துகின்றன / They restrict movement of molecules
- ஏற்றத்தை மாற்றுகின்றன / They change the charge
- சாயம் சேர்க்கின்றன / They add stain
- -
பதில் / Answer
- சுயகதிரியல் / Autoradiography
- ருஏ (UV) ஒளி / UV light
- எடைமானி / Balance
- நிறமாலை / Spectrum of visible light only
- -
பதில் / Answer
- பிளாஸ்மிட் / Plasmid
- DNA விரலடையாளம் (fingerprint / genetic profile) / DNA fingerprint
- கோடான் / Codon
- வெக்டர் / Vector
- -
பதில் / Answer
- அகரொஸ் ஜெல் மின்னயனத்தில் DNA எவ்வாறு வேறாக்கப்படுகிறது என்பதையும், அது அனோட்டை நோக்கி அசைவதன் காரணத்தையும் விளக்குக. / Explain how DNA is separated in agarose gel electrophoresis and why it migrates to the anode. (3)
- DNA ஆயி (probe) என்றால் என்ன? அது எவ்வாறு சுட்டியிடப்படும் (label) என்பதை இரு வழிகளில் கூறுக. / What is a DNA probe? Give two ways it can be labelled. (3)
- சதேர்ன் ஒத்தியின் (Southern blotting) நோக்கத்தைச் சுருக்கமாகக் கூறுக. / State the purpose of Southern blotting. (2)
- STR குறிப்பான்கள் DNA விரலடையாளத்திற்கு ஏற்றவை என்பதற்கு இரு காரணங்களைக் கூறுக. / Give two reasons why STR markers are suitable for DNA fingerprinting. (2)
மாதிரி விடை / Model answer
(ஆ) ஆயி — நிரப்புகின்ற தொடரியைக் கண்டறியும் தனித்த பட்டிகை சுட்டியிடப்பட்ட DNA துண்டம்; சுட்டியிடல் — கதிர்த்தொழிற்பாட்டு சமதானி / உறிஞ்சியொளிவீசும் மூலக்கூறு. (3)
(இ) ஜெல்லிலுள்ள இயற்கையகற்றப்பட்ட பட்டைகளை மென்சவ்வுக்கு இடமாற்றி, ஆயியால் குறிப்பிட்ட தொடரியைக் கண்டறிய. (2)
(ஈ) பிறப்புரிமைத் தொகுதியில் அடிக்கடி காணப்படல்; PCR மூலம் இலகுவாகப் பெருக்கல்; உயர் மாறுபாட்டுத்தன்மை (ஏதேனும் இரண்டு). (2)
அகரொஸ் ஜெல் மின்னயனம் முதல் DNA விரலடையாளம் வரை, ஒரு குறிப்பிட்ட DNA தொடரியைக் கண்டறிந்து தனிநபரை இனங்காணும் முழுச் செயன்முறையை விபரிக்க. / Describe the complete process — from agarose gel electrophoresis to DNA fingerprinting — used to detect a specific DNA sequence and identify an individual.
விடைக் குறிப்புகள் / Answer outline
• அகரொஸ் ஜெல் மின்னயனம் — கிணறு, தாங்கல், கதோடு/அனோடு; எதிர் ஏற்ற DNA அனோட்டை நோக்கி; பருமன் வேறாக்கல்; எதிடியம் புரோமைடு + ருஏ.
• குறிப்பிட்ட தொடரியை இனங்காண — DNA ஆயி (தனித்த பட்டிகை, சுட்டியிடப்பட்ட); இரட்டை DNA இயற்கையகற்றல்.
• சதேர்ன் ஒத்தி — நைலோன் மென்சவ்வுக்கு இடமாற்றம்; ஆயி கலப்புப்பிறப்பாக்கம்; கழுவல்; சுயகதிரியல்/UV மூலம் இலக்குப் பட்டை.
• DNA விரலடையாளம் — STR குறிப்பான்கள் (2–6 bp, குறியீடற்ற); PCR; பல குறிப்பான் → குற்ற இனங்காணல், தந்தை உரிமை, தொற்று நோய்க்காரி.
பதில் / Show answer
- DNA துண்டுகளை அளவு வாரியாகப் பிரிக்கும்.
- DNA எதிர்மின் → நேர்முனை (anode) நோக்கி நகரும்.
- சிறிய துண்டு வேகமாக, தொலைவாக நகரும்.